ELISA試劑盒測定的主要原理是利用抗原、抗體之間的特異反應(yīng)通過某一種或幾種酶來連接待測物，通過底物和酶的相互作用，會改變?nèi)芤旱念伾M(jìn)而通過觀察溶液顏色來判定測定的結(jié)果。在生物學(xué)科的研究中，ELISA是zui為常用，也是zui為重要的一種生物指標(biāo)檢測方法。信帆生物的技術(shù)人員根據(jù)自己多年的經(jīng)驗(yàn)，針對ELISA測定實(shí)踐中存在的常見問題及其發(fā)生原因進(jìn)行剖析，具體分析如下。 

1 假陰性出現(xiàn)的原因分析及建議： 
　　導(dǎo)致假陰性的原因主要包括以下幾種情況，①如果檢測大批量樣本，實(shí)驗(yàn)室檢測人員的工作量比較大，有時候可能觀察樣本呈色不及時，很多樣本在實(shí)驗(yàn)者觀察時，結(jié)果已經(jīng)褪色，導(dǎo)致樣本呈現(xiàn)假陰性。②試劑自身的質(zhì)量并沒有達(dá)標(biāo)，比如已經(jīng)過了保質(zhì)期，試劑保存的方法不恰當(dāng)，在試劑運(yùn)輸?shù)倪^程中，破壞了樣本，蒸餾質(zhì)存在其他混合物。如果缺乏陰陽對比，極易出現(xiàn)假陰性。③溫育、溫度不充分，作用時間過短，忘記添加底物顯色劑或者酶標(biāo)二抗等，這些原因都可能導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性。④部分生物試劑試劑廠家經(jīng)濟(jì)條件較差，儀器、設(shè)備等比較落后，特別是若為人工包被的話，和普通試劑相比，生物活性材料存在很大不同，常常容易出現(xiàn)“漏包”、抗體（抗原）失去活性或活性不足等現(xiàn)象，進(jìn)而出現(xiàn)假陰性。⑤在檢測的過程中，加樣技術(shù)非常重要，由于ELISA 測定法僅僅是微量樣品，如果多加1ul樣品或者少加1ul樣品，極易導(dǎo)致檢測標(biāo)本的測定結(jié)果一時陽性，一時陰性。 
　　2 樣本假陽性的原因分析及其建議： 
　　導(dǎo)致樣本出現(xiàn)假陽性的原因主要包括以下幾種情況： 
　　

     2.1 吸附作用。很多SLE或者類風(fēng)濕等具有自身免疫疾病患者，他們的血清中常常會存一些特殊組成成分對樣本測定的結(jié)果準(zhǔn)確性造成影響，比如在包被板上會輕微吸附著一些IgG 抗體，這些附著的IgG抗體會導(dǎo)致之前顯示陰性樣本顯色，這種情況顯然是失真的。如果遇到這種情況建議結(jié)合樣本具體情況進(jìn)行判斷，并且應(yīng)該在樣本測定結(jié)果中標(biāo)注特殊情況。 
　　2.2 標(biāo)本中雜質(zhì)的影響。在檢測標(biāo)本中，如果血液樣本黏稠度過高，血清脂質(zhì)含量、膽紅素含量、血紅蛋白含量等過高，都會干擾ELISA測定結(jié)果，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。 
　　2.3 內(nèi)源性物質(zhì)。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)^[3]，大約有40%左右的學(xué)者認(rèn)為樣本血清中都存在某些對ELISA測定結(jié)果存在交叉反應(yīng)物質(zhì)、醫(yī)源性誘導(dǎo)抗鼠Ig（s）抗體、嗜異性抗體、補(bǔ)體、類風(fēng)濕因子或者其他干擾作用物質(zhì)等，在一定程度上會干擾樣本測定結(jié)果的準(zhǔn)確性，會導(dǎo)致樣本檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性。 
　　2.4 外源性物質(zhì)。在采集樣本和保存樣本的過程中，常常會由于實(shí)驗(yàn)室操作人員操作不規(guī)范而導(dǎo)致樣本測定結(jié)果出現(xiàn)假陽性。比如：①樣本溶血現(xiàn)象。這種問題常常是由于人為操作因素所致，在破壞溶解紅細(xì)胞過程中會產(chǎn)生大量血紅蛋白，ELISA的標(biāo)記主要以辣根過氧化物酶為主，而這些血紅蛋白的過氧化物酶活性較強(qiáng)，因此一旦采集標(biāo)本出現(xiàn)溶血現(xiàn)象，會出現(xiàn)非特異性顯色反應(yīng)，導(dǎo)致樣本檢測出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。因此研究檢驗(yàn)實(shí)踐中應(yīng)重視標(biāo)本溶血問題。②保存標(biāo)本的方法不恰當(dāng)，如果存放存標(biāo)本的時間在1d以上，則很容易導(dǎo)致標(biāo)本活性喪失或大大降低，出現(xiàn)假陰性問題。如果標(biāo)本待檢時間過長，標(biāo)本血清中IgG 抗體極易形成多聚體，而AFP抗體極易形成二聚體，二聚體和多聚體相互結(jié)合極易導(dǎo)致本底過深，進(jìn)而使樣本測定結(jié)果出現(xiàn)假陽性。因此在研究檢測過程中，應(yīng)該在zui短的時間內(nèi)進(jìn)行ELISA 測定，如果由于特殊情況必須將測定時間延長，則應(yīng)該將標(biāo)本存放環(huán)境設(shè)定為4℃恒溫（5d內(nèi)）。若標(biāo)本在7d后檢測，應(yīng)采取低溫冷凍處理，在檢測前再測解凍，并輕輕充分搖勻后測定。 
　　2.5 并沒有全面凝集標(biāo)本。由于血液采集后在30min-2h后逐漸開始凝固，在24h左右會*凝固，因此在ELISA 檢測過程中，常常會在血液標(biāo)本中適當(dāng)添加一些促凝劑或抗凝劑，為了爭取有效的檢測時間會強(qiáng)行將血清分離出來。此時血清中仍然有部分纖維蛋白原殘留，并極易形成纖維蛋白塊，這些肉眼可見的纖維蛋白塊會使實(shí)驗(yàn)者判斷失誤，導(dǎo)致樣本測定出現(xiàn)假陽性。這種問題其實(shí)比較好解決，導(dǎo)致這種現(xiàn)象的主要原因是血液還沒有*凝固所致，研究檢測時只需要待血液*凝固后分離血清即可。如果特殊情況下需要快速檢測，則應(yīng)該使用分離膠采血管或者加入一定量促凝劑。 

　　3 檢測操作誤差： ELISA 測定基本上都是手工操作，會無可避免的存在某些誤差，如果樣品加入時間，加入試劑以及混合時間存在出入，極易造成操作時差。在操作過程中，應(yīng)在加樣后輕輕混合均勻，不能混用不同批號試劑，試劑瓶和試劑蓋應(yīng)仔細(xì)檢查，避免出現(xiàn)張冠李戴現(xiàn)象。應(yīng)確保試劑保存的溫度、保存時間、洗滌方法、顯色條件等保持一致，在檢測時應(yīng)注意避免試劑、樣本、板以及吸頭污染。若在閾值附近出現(xiàn)檢測結(jié)果時陰時陽現(xiàn)象，不要急于做出判斷，應(yīng)重復(fù)多次進(jìn)行檢測，zui終的檢測結(jié)果應(yīng)以偶數(shù)結(jié)果為判定標(biāo)準(zhǔn)。 
　　根據(jù)以上常見問題及其原因的分析，主要存在樣本測定結(jié)果假陰性、假陽性等問題，應(yīng)綜合考慮人為操作因素、試劑因素、標(biāo)本因素等多方面影響，及早查明影響ELISA 測定的根本原因，并及時糾正進(jìn)行重新測定，確保ELISA 測定結(jié)果的準(zhǔn)確性、可靠性，為研究提供科學(xué)依據(jù)。