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      上海信帆為您甄選:western blot檢測中異常實驗結(jié)果分析!

      更新時間:2020-06-18      瀏覽次數(shù):2313

      上海信帆為您甄選:western blot檢測中異常實驗結(jié)果分析!

      上海信帆生物提供western blot檢測服務(wù),很多老師自己做實驗的時候會出現(xiàn)各種異常情況,本公司把可能導(dǎo)致的原因做了一個整理匯總,希望對廣大剛?cè)腴T的用戶有所幫助,下面就讓我們一起來看看吧!

      關(guān)于Western blot實驗異常分析


      『無信號』

      原因建議
      一抗與二抗不匹配選擇針對一抗來源種屬制備的二抗;
      一抗不識別目的的種屬的蛋白

      1)檢查抗體的說明書,適用范圍內(nèi)是否包含目的種屬
      2)使用陽性對照來檢查抗體質(zhì)量

      一抗或二抗不足,沒有足夠的抗體結(jié)合到目的蛋白

      1)降低抗體稀釋倍數(shù),增加抗體濃度
      2)延長孵育時間

      封閉劑與一抗有交叉反應(yīng)改變封閉劑
      抗原不足

      1)每個泳道加入20-30ug總蛋白
      2)制備樣品要使用蛋白酶抑制物及使用陽性對照

      在檢測的組織內(nèi)目的蛋白表達水平低檢測樣本不表達目的蛋白選擇表達量高的細胞作為陽性對照,用于確定檢測樣本是否為陰性,也可更換細胞系
      蛋白轉(zhuǎn)膜效率低

      1)利用麗春紅檢測轉(zhuǎn)膜效率;檢查轉(zhuǎn)移裝置是否電極弄反
      2)轉(zhuǎn)移前膜是否用甲醇侵泡過

      膜過渡洗滌減少洗滌時間和強度
      疊氮鈉抑制二抗活性二抗稀釋液內(nèi)不用疊氮鈉

       

       

      『沒有特異條帶』

      原因建議
      細胞系傳代過多后蛋白表達譜發(fā)送變化1)使用未傳代或傳代次數(shù)較少的細胞系進行樣品制備
      蛋白本身有很多修飾1)查閱文獻,確定目的蛋白是否存在多種修飾
      蛋白被消化或者降解1)蛋白樣品確保未被污染,確保含有蛋白酶抑制劑
      所檢測蛋白存在多種剪接體,導(dǎo)致分子量大小不同1)查閱文獻或者通過搜索數(shù)據(jù)庫來確定該蛋白是否存在多種長度不同的編碼mRNA
      一抗或二抗?jié)舛雀?/td>1)減低抗體濃度
      洗滌不夠1)充分洗滌

       

       

      『條帶大小不正確』

      原因建議
      目的蛋白被降解確保蛋白樣品未被污染,確保含有蛋白酶抑制劑
      存在不同的剪接體查閱文獻或者通過搜索數(shù)據(jù)庫來確定該蛋白是否存在多種長度不同的編碼mRNA
      重組蛋白檢測是否存在額外加入的蛋白
      特殊蛋白如MDM2等仔細閱讀抗體說明書

       

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