考馬斯亮藍法測蛋白含量的正確使用方法！

考馬斯亮藍法測蛋白含量的正確使用方法！

樣品可溶性蛋白質含量常常用于酶活性計算。此外，可溶性蛋白質含量也用于食品等質量分析。

在酸性溶液中，考馬斯亮藍G-250與蛋白質結合形成藍色復合物；該復合物在595nm處有最大吸收峰， 其顏色的深淺與蛋白質的濃度成正比。該方法靈敏度高，適合微量蛋白質分析。

使用所需設備：

產品組成：

試劑一：液體×1瓶，4℃保存。

標準品：液體×1瓶，4℃保存。

樣品中可溶性蛋白質提取：

液體樣品：澄清無色液體樣品可以直接測定。

組織樣品：準確稱取約0.1 g樣品，加1mL提取液（自備，根據需要選用酶提取緩沖液或者蒸餾水或者生理鹽水），冰浴勻漿，10000rpm，4℃離心10min，取上清，即待測液。（動物樣品常常需要稀釋）

吸光值測定：

1. 分光光度計預熱30 min以上，蒸餾水調零。

2. 空白管：取0.5mL EP管，加入40μL蒸餾水，250μL試劑一，混勻后室溫靜置10min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于595nm比色，10~20min完成比色，記為A空白管。

3. 標準管：取0.5mL EP管，加入40μL標準液，250μL試劑一，混勻后室溫靜置10min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于595nm比色，10~20min完成比色，記為A標準管。

4. 測定管：取0.5mL EP管，加入40μL待測液，250μL試劑一，混勻后室溫靜置10min，取200μL于微量玻璃比色皿/96孔板，于595nm比色，10~20min完成比色，記為A測定管。

蛋白質含量計算公式：

C待測（µg/m L）= C標準管×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)

                =50×(A測定管－A空白管)÷(A標準管－A空白管)

C標準管：標準品蛋白質濃度，50μg/mL。

注意事項：

1.加考馬斯亮藍后，在10~20min內吸光值相對較穩定，因此須在10~20min完成比色。

2.不宜用石英比色皿，可用玻璃或塑料比色皿，測完成后立即用95%乙醇沖洗。

3.測定前用1~2個樣做預實驗，確保蛋白濃度在0~100µg/ml范圍內，否則需要做相應稀釋。