原位雜交實驗的實驗流程和樣本處理注意事項

 原位雜交實驗的實驗流程和樣本處理注意事項

上海信帆提供原位雜交實驗檢測服務。原位雜交實驗通常流程由組織切片+探針+DAB染色+掃片或者拍照構成，那么詳細的操作步驟和對樣本的處理要求具體是什么呢，讓我們一起來探索一下吧！

實驗流程：

　　1、組織固定：組織取出洗凈后立即放入固定液(DEPC水配制)中固定2-12h。

　　2、脫水：組織固定完成后經梯度酒精脫水后浸蠟，包埋。

　　3、切片：石蠟經切片機切片，攤片機撈片，62°烤箱烤片2h。

　　4、石蠟切片脫蠟至水：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-85%酒精5min-75%酒精5min-DEPC水洗。

　　5、消化：根據組織固定時間長短，切片于修復液中煮沸10-15分鐘，自然冷卻。后基因筆畫圈，根據不同組織不同指標特性，滴加蛋白酶K(20ug/ml) 37°消化20-30 min。純水沖洗后PBS洗3次×5min。

　　6、阻斷內源性過氧化物酶：滴加3%甲醇-H2O2，室溫避光孵育15min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

　　7、預雜交：滴加預雜交液，37°C孵育1h。

　　8、雜交：傾去預雜交液，滴加含探針雜交液, 恒溫箱 37度雜交過夜。

　　9、雜交后洗滌：洗去雜交液，2×SSC，37°C 洗10min，1×SSC，37°C洗2×5min，0.5×SSC室溫洗10min。若非特異雜交體較多，可以增加甲酰胺洗滌。

　　10、滴加封閉液：滴加封閉血清 BSA。室溫30min。

　　11、滴加鼠抗高辛標記過氧化物酶(anti-DIG-HRP)：傾去封閉液，滴加anti-DIG-HRP。37°C孵育40min，后PBS洗4次×5min。

　　12、DAB顯色：切片稍甩干后，在圈內滴加新鮮配制的DAB顯色液，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，純水沖洗切片終止顯色。

　　13、復染細胞核：Harris蘇木素復染3min左右，自來水洗，1%鹽酸酒精分化數秒，自來水洗，氨水返藍，流水沖洗。

　　14、脫水封片：將切片依次放入75%酒精6min-85%酒精6min—100%酒精I 6min—100%酒精II 6min-正丁醇6min—二甲苯透明，將切片從二甲苯中拿出稍晾干后，中性樹膠封片。

　　15、顯微鏡檢，圖像采集分析。

　　結果判讀：

　　陽性為棕黃色，細胞核為藍色。

送樣要求：

1、切片前處理要求：新鮮組織干冰運輸后做冰凍切片；或取2mm左右厚度的新鮮組織，5min內投入原位雜交固定液內固定，4℃低溫保存運輸，切勿冷凍結冰，盡快包埋切片后進行原位雜交實驗，固定時間過長影響核酸檢出率；

2、冰凍切片：冰凍切片-20℃運輸；

3、石蠟切片：石蠟切片常溫運輸；

4、細胞爬片：細胞爬片加原位雜交固定液固定15min后，換無酶PBS，密封，4℃運輸。

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