血清脂蛋白瓊脂糖電泳實驗及相關緩沖液

血清脂蛋白經蘇丹黑B染色后，以瓊脂糖為載體，在pH8.6巴 比Q妥緩沖液中進行電泳，可將脂蛋白分成不同的區帶。按電泳移動的速度不同，正常人血清脂蛋白可出現三條區帶，從陰極到陽極依次為β-脂蛋白（最深）、前β-脂蛋白（最淺）、α-脂蛋白（比前β-脂蛋白略深些）。在原點處應無乳糜微粒，也見不到中間脂蛋白的條帶，有時前β-脂蛋白也顯示不出來。 前β-脂蛋白比α-脂蛋白深染，且血清甘油三酯明顯升高，膽固醇正常或略高，可以確定為Ⅳ型高血脂癥。 β-脂蛋白區帶比正常明顯深染，血清總膽固醇明顯增高而甘油三酯正常者為Ⅱa型高血脂癥，血清總膽固醇增高而甘油三酯略高和前β深染者則為Ⅱb型高血脂癥。 β和前β-脂蛋白兩條區帶連在一起彼此難以區分稱為“寬β區帶"，同時血清甘油三酯和膽固醇均有增高，可定為Ⅲ型高血脂癥。 原點出現乳糜微粒，β和前β均正常或降低，同時血清甘油三酯明顯增高，可定為Ⅰ型高血脂癥。

一、試劑

1.血清。

2.蘇丹黑B染色液 蘇丹黑B的飽和無水乙醇溶液，用前過濾。

3.信帆生物電泳緩沖液（pH8.6，離子強度0.075）為電極緩沖液。我司推薦相關緩沖液，安全無危害，可以替代巴比T妥緩沖液。使用更放心，結果無影響

4.Tris緩沖液（pH8.6）為凝膠緩沖液。Tris1.212g，EDTA酸0.292gNaCL5.85g，加水溶解后再加水至1000mL。

5.瓊脂糖凝膠 瓊脂糖0.45g，Tris緩沖液50mL，加水50mL，邊攪拌邊加熱至沸騰，待瓊脂糖溶解后立即停止加熱。

6.水平電泳設備。

7.37℃水浴。

8.離心機。

9.載玻片

10.切口刀 刀口長15mm的刀片兩片，中央夾一有機玻璃或木片，用螺絲固定，使兩片刀片相距1.5mm。用相應的打槽器更好。

11.挖槽小匙 用直徑1.5mm的銅絲約6cm長，一端錘成扁平，用細砂紙磨光（用剪好的X光片亦可）。

血色素管或微量加樣器。

二、操作步驟

1.預染血清 血清0.2mL加蘇丹黑B染色液0.02mL于小試管中，混合后置37℃水浴染色30分鐘。然后2000r/min離心5分鐘。

2.制備瓊脂糖凝膠板 將已經配置的0.45%瓊脂糖凝膠置于沸水浴中加熱融化。用吸管吸取凝膠溶液澆注載玻片，每片約2.5mL，靜置約半小時后凝固（天熱時需延長，或放冰箱數分鐘加速凝固）。

3.點加血清 在已經凝固的瓊脂糖凝膠板距離一端約2cm處，用切口刀片（打槽器）垂直切入凝膠后立即取出，然后用銅絲小匙將長方小條凝膠取出。以小片濾紙吸干小槽內水分，用血色素吸管吸取經過預染的血清約15μl，注入凝膠板上的小槽內。

4.電泳 將加過血清的凝膠板平行放于電泳槽中，樣品放于陰極一端。兩塊三層紗布于信帆生物電泳緩沖液中浸濕，然后輕輕緊貼在凝膠板兩端，紗布的另一端浸于電泳槽內的信帆生物電泳緩沖液中（注意：此電極緩沖液不能用三羥甲基氨基甲烷緩沖液代替）。接通電源，電壓為120~130V，每片電流為3~4mA。約經45至55分鐘，即可見到分離的色帶。1.電泳樣品應為新鮮的空腹血清。

2.加熱溶化瓊脂時，須防止水分蒸發過多。瓊脂凝膠最好隨用隨制，以免凝膠表面干燥，影響分離結果。

3.在α-脂蛋白前若出現較淺區帶，可列為α-前脂蛋白。

4.如果要保存電泳圖形，可將凝膠板（連同玻片），置于清水中浸泡2小時脫鹽，而后放入干燥箱（80℃左右）烘干即可。

5.制作凝膠板是瓊脂糖濃度一般選用0.5%左右為宜，高于1%以上α-脂蛋白部分較緊密，β-和前β-脂蛋白部分不夠清晰，低于0.45%則凝膠凝固性較差，圖譜不清。

6.樣品槽要大小適宜，邊緣整齊、光滑，否則會影響電泳圖形。