信帆生物：WB（免疫印記）實(shí)驗(yàn)的樣本取材和郵寄方法

以下所有樣本必須在送樣管上標(biāo)記清楚樣本編號(hào)，-80℃冰箱凍存（-80℃凍存時(shí)間不超過一個(gè)月，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致蛋白降解），全程干冰運(yùn)輸送樣。

一、動(dòng)物組織樣本

1、動(dòng)物處死后5min內(nèi)取樣，全程冰上操作，先取易降解的組織，如胰腺、腸、胃等，再取其它組織，組織塊至少取50mg以上（黃豆大?。?。組織取好后用預(yù)冷的PBS輕輕漂洗掉樣本表面的血污，例如心、肝、脾、腎等血污較多的組織，可用預(yù)冷PBS清洗多次，直至血污清洗干凈，用濾紙吸干組織表面液體，立即放入EP管或凍存管中-80℃保存。

2、腸，胃，血管，食管，子宮等標(biāo)本，取材后立即把組織切開用預(yù)冷PBS清洗多次，去除內(nèi)容物，用濾紙吸干組織表面液體，立即放入EP管或凍存管中-80℃保存。

3、脊髓，主動(dòng)脈，氣管，神經(jīng)等標(biāo)本長(zhǎng)度不得少于1cm。

4、視網(wǎng)膜需單獨(dú)剝離，小鼠至少需要4個(gè)視網(wǎng)膜合并，大鼠至少需要2個(gè)視網(wǎng)膜合并。

5、卵巢需單獨(dú)剝離，去除周圍脂肪，小鼠至少需要2個(gè)卵巢合并。

6、皮膚樣本需去凈毛發(fā)。

如有特殊特定部位請(qǐng)?zhí)峁┰敿?xì)取材要求或參考圖。

二、細(xì)胞樣本（細(xì)胞量至少10⁶，細(xì)胞沉淀綠豆大小）

1、懸浮細(xì)胞：

①將細(xì)胞及培養(yǎng)基一起吸入離心管中，4℃低速離心（不超過3000rpm）5min，去上清，收集細(xì)胞沉淀。

②加入1mL PBS溶液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，4℃低速離心（不超過3000rpm）5min，去上清，收集細(xì)胞沉淀，細(xì)胞沉淀要有綠豆大小。

2、貼壁細(xì)胞：

方法一：消化法

①培養(yǎng)好的細(xì)胞棄培養(yǎng)基，加入胰酶消化。

②胰酶消化后（時(shí)間不宜過長(zhǎng)），加培養(yǎng)基終止消化，輕輕吹打至細(xì)胞懸浮。吸入離心管，4℃低速離心（不超過3000rpm），5min。

③棄上清，加PBS重懸細(xì)胞，4℃低速離心（不超過3000rpm）5min，去上清，收集細(xì)胞沉淀，細(xì)胞沉淀要有綠豆大小。

方法二：刮取法

①培養(yǎng)好的細(xì)胞棄培養(yǎng)基，加入PBS，用細(xì)胞刮沿一個(gè)方向輕輕刮下細(xì)胞，切記不要反復(fù)刮，避免細(xì)胞刮破。

②細(xì)胞液收集至離心管內(nèi)，4℃低速離心（不超過3000rpm）5min，去上清，收集細(xì)胞沉淀，細(xì)胞沉淀要有綠豆大小。

備注：不要寄送培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶，運(yùn)輸過程中細(xì)胞容易脫落且造成細(xì)胞活力下降，培養(yǎng)板有漏液風(fēng)險(xiǎn)，造成樣本污染。

三、菌液，外泌體，血清，細(xì)胞上清等，一個(gè)指標(biāo)至少20μL，濃度1μg/μL以上，-80℃保存。

四、全血樣本至少1mL，抗凝管4℃保存運(yùn)輸，保存時(shí)間不要超過5天，凝血的樣本不能用于WB檢測(cè)。

五、提取好的蛋白變性后干冰運(yùn)輸。建議按以上方法提供樣本在我司提取蛋白。

注：提取特殊蛋白，如膜蛋白，線粒體蛋白，核蛋白所需樣本量要翻倍，即組織100mg以上，細(xì)胞沉淀量黃豆大小。

具體蛋白提取方法如下：

細(xì)胞總蛋白提?。?/span>

1、懸浮細(xì)胞裂解步驟：

①培養(yǎng)細(xì)胞量至10⁶，將細(xì)胞及培養(yǎng)基一起吸入離心管中，4℃低速離心（不超過3000rpm）5min，去上清，收集細(xì)胞沉淀。

②加入1mL PBS溶液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到1.5mL離心管中，4℃低速離心（不超過3000rpm）5min，去上清，收集細(xì)胞沉淀。

③根據(jù)細(xì)胞沉淀量加入10倍體積的全裂解液（全裂解液配方：RIPA裂解液(G2002)+50*cocktail(G2006)+PMSF(100mM)(G2008)+磷酸化蛋白酶抑制劑(G2007)，比例是100:2:1:1，使用前加入蛋白酶抑制劑），沉淀體積為綠豆大小（大概20μL）加入200μL全裂解液（如需提高蛋白濃度，可適量減少裂解液體積），冰浴30 min；（期間每隔5min將離心管放置渦旋混勻儀（SMV-4500B）震蕩混勻，整個(gè)過程必須在冰盒上操作，防止蛋白降解）。

2、貼壁細(xì)胞裂解步驟：

①培養(yǎng)細(xì)胞量至10⁶，倒掉培養(yǎng)基，沿平皿側(cè)壁或者培養(yǎng)瓶瓶口緩慢加入PBS溶液（G2156-1L）輕輕搖晃潤(rùn)洗，然后將細(xì)胞培養(yǎng)板/瓶?jī)A斜放置，用移液器輕輕吸除殘余液體，清洗2次，最后一次將殘余PBS全吸凈（清洗過程需輕柔操作，不要將細(xì)胞沖掉）。

②加入適當(dāng)體積的全裂解液，單孔加入250μL全裂解液（如需提高蛋白濃度，可適量減少裂解液體積），反復(fù)晃動(dòng)，讓裂解液與細(xì)胞充分接觸，用細(xì)胞刮刀刮下細(xì)胞，將裂解液及細(xì)胞收集到1.5mL EP管中，冰浴30 min（期間每隔5min將離心管放置渦旋混勻儀震蕩混勻，整個(gè)過程必須在冰盒上操作，防止蛋白降解）。

裂解完成后，12000rpm，4℃，離心10min，取上清放入新的1.5mL EP管（EP-150-M）

中，上清即為總蛋白溶液（EP管上需寫清楚樣本編號(hào)）。

組織總蛋白提取：

1、組織塊用預(yù)冷的PBS洗滌2~3次，去除血污，剪成小塊置于勻漿管（HT-200-M）中，加入2顆4mm的研磨珠（G0204-150G），加入10倍組織體積的全裂解液（使用前加入蛋白酶抑制劑）（如需提高蛋白濃度，可適量減少裂解液體積），設(shè)置低溫研磨儀（KZ-III-FP）勻漿程序進(jìn)行勻漿。

2、勻漿完成后，冰浴30 min（期間每隔5min將離心管放置渦旋混勻儀震蕩混勻，整個(gè)過程必須在冰盒上操作，防止蛋白降解）。

3、裂解全后12000rpm，4℃，離心10min，取上清放入新的1.5mL EP管中（不要吸到底部沉淀），即為總蛋白溶液（EP管上需寫清楚樣本編號(hào)）。

信帆生物：WB（免疫印記）實(shí)驗(yàn)的樣本取材和郵寄方法