豬ELISA試劑盒包被夾心法在抗原定量測(cè)定中的應(yīng)用

       我們?yōu)榇蠹医榻B一下豬的ELISA試劑盒在測(cè)試抗原定量中的應(yīng)用。用豬瘟病毒中國免化弱毒疫苗株（CSFV C株）為實(shí)驗(yàn)材料,首先采用常規(guī)細(xì)胞實(shí)時(shí)計(jì)數(shù)的方法,得到正常犢牛睪丸細(xì)胞增殖曲線和帶毒睪丸細(xì)胞的增殖曲線,結(jié)果發(fā)現(xiàn)豬瘟病毒不僅不影響犢牛睪丸細(xì)胞的生長,反而促進(jìn)細(xì)胞的分裂增殖,培養(yǎng)48小時(shí)時(shí),帶毒的牛睪丸細(xì)胞計(jì)數(shù)是未帶毒細(xì)胞的117.5%。初步確立了該毒株在原代犢牛睪丸細(xì)胞中增殖的規(guī)律與基本特性。

         再進(jìn)一步運(yùn)用直接免疫熒光法確定出*細(xì)胞初始密度、*接毒量及接毒方式的產(chǎn)毒模型,建立了常規(guī)的病毒增殖曲線。 以建立的細(xì)胞及病毒生長曲線及產(chǎn)毒模型為依據(jù),根據(jù)GMP生物試劑車間的實(shí)際情況,從生物試劑種毒繁殖、原代細(xì)胞制備、CSFV的感染、CSFV感染后維持液的調(diào)節(jié)以及帶CSFV的犢牛睪丸細(xì)胞的多次傳代這幾個(gè)對(duì)CSFV增殖有影響的因素方面入手進(jìn)一步展開工作。 嚴(yán)格控制生物試劑種毒,達(dá)標(biāo)的生物試劑種毒,是疫苗病毒含量達(dá)標(biāo)的必要保障。原代細(xì)胞制備過程中,依據(jù)《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》（以下簡稱:《規(guī)程》）無菌摘取犢牛睪丸,在《規(guī)程》的指導(dǎo)基礎(chǔ)上,調(diào)整消化時(shí)間、溫度可以同時(shí)達(dá)到提高細(xì)胞數(shù)量及質(zhì)量的雙重效果。將《規(guī)程》消化時(shí)間調(diào)整為0.25%的胰酶37℃消化30 min后降低溫度繼續(xù)消化。結(jié)果,每1g睪丸組織可制備3×105個(gè)/ml細(xì)胞懸液400-500ml,是傳統(tǒng)消化法的兩倍,并且細(xì)胞活力明顯增強(qiáng),消化后期降低溫度可減輕后期胰酶的作用強(qiáng)度,減少對(duì)已消化好細(xì)胞的傷害。 脾組織毒對(duì)次代牛睪丸細(xì)胞有很強(qiáng)的刺激作用,生物試劑接毒時(shí)適度減少組織毒,同時(shí)補(bǔ)入一定量病毒含量≥106細(xì)胞毒液,可減少組織毒對(duì)細(xì)胞的刺激作用,降低細(xì)胞的脫瓶率,提高病毒液的收次。 在病毒液收獲期間,增大維持液量,將《規(guī)程》中10%的維持液調(diào)節(jié)為20%,4天收獲一次延長為8天收獲一次,經(jīng)兔體檢驗(yàn),病毒含量仍能達(dá)到5×104ml。病毒含量測(cè)定方面,應(yīng)用豬瘟抗原/血清ELISA試劑盒（IDEXX HerdCheck Co.）對(duì)經(jīng)兔體檢驗(yàn)已知滴度的20份HCLV半成品細(xì)胞病毒液、10份兔體檢驗(yàn)檢驗(yàn)陰性HCLV半成品細(xì)胞病毒液、10份凍干成品疫及10份凍干脾淋苗進(jìn)行抗原含量測(cè)定,并與兔體定型熱反應(yīng)法的結(jié)果進(jìn)行對(duì)照,結(jié)果半成品檢測(cè)結(jié)果與兔體檢驗(yàn)相關(guān)率可達(dá)95%,成品75%。ELISA法可快速、穩(wěn)定、簡單地運(yùn)用于HCLV細(xì)胞苗的半成品與成品的病毒含量測(cè)定,并可反向檢測(cè)兔體檢驗(yàn)的不敏感性,降低檢驗(yàn)誤判,同時(shí)提高產(chǎn)品的質(zhì)量及產(chǎn)量。