農殘檢測ELISA試劑盒研究

    本研究以農藥三唑磷及克百威為研究對象，采用分子模擬方法對其半抗原分子進行了設計并合成得到了兩種優化的三唑磷半抗原兩種半抗原O-乙基，O-[1-苯基-（H-1,2,4-三唑-3-基），N-（3-羧基-丙基）]硫代磷酸胺（THBu）、O-乙基，O-[1-苯基-（H-1,2,4-三唑-3-基）,N-（5-羧基-丙基）]硫代磷酸胺（THHe）和一種克百威半抗原4—[[（2，3-二氫-2，2-二甲基-7-苯并呋喃基氧）羰基]氨基]丁酸（BFNB）。上述半抗原分別與載體蛋白偶聯制備成人工抗原，免疫小白鼠，再采用雜交瘤技術制備出了對應單克隆抗體。經測定，抗體（腹水）的效價均在10~6以上，與對應農藥的結構類似物的交叉反應率均較低，表現出很高的特異性。 在此基礎上，通過對固相載體、包被緩沖液、有機溶劑、包被條件、洗滌次數、酶的種類、封閉物種類、點板時間、工作濃度、穩定劑以及不同ELISA模式等因素的篩選比較，優化了三唑磷和克百威ELISA方法和條件。優化后結果顯示：Costar酶標板（美國）吸附效果和均一性較好；抗體以PBS（pH 7.4，0.01M）作為包被介質較為理想，人工抗原則以CBS（pH 9.5，0.05M）作為包被介質較為理想；包被條件以在37℃下包被2h效果為佳；反應介質加入2％牛奶可減少非特異性吸附，提高檢測靈敏度；有機溶劑中甲醇對ELISA反應的影響較小，反應體系中zui終含量10％為佳；HRP酶作為顯色反應的催化劑比AP酶更為理想；包被抗原直接競爭ELISA模式OD值的平行性不如包被抗體直接競爭ELISA模式的好；優化出的穩定劑可使包被在酶標板上的抗體在37±1℃條件下保存14天而抗體活性基本保持不變。 利用優化后的分析條件，建立了農藥三唑磷異源直接競爭ELISA方法（包被抗體模式）和克百威直接競爭ELISA方法（包被二抗模式）。在考察了不同樣品基質對ELISA方法的影響后，進一步對蔬菜樣品、水果樣品、水、土等環境樣品進行了三唑磷和克百威添加回收率試驗，檢測結果進行了統計分析，考察了方法的準確度與精密度，并對不同處理組間、相同處理組板間的檢測數據進行了顯著性檢驗，確定了不同樣品的方法本底值、zui低檢測限及檢測結果陰性／陽性判定方法，zui終構建了三唑磷ELISA快速測定試劑盒和克百威ELISA快速測定試劑盒。結果表明，三唑磷ELISA方法的檢測靈敏度達到了2.66 ng／mL（檢測線性范圍為1.95-2000ng／mL），克百威ELISA方法的檢測靈敏度為0.97 ng／mL（檢測線性范圍為0.8-340 ng／mL），實際樣品中的zui低檢測限達到或接近（部分超過）了一些國家和地區的殘留*（MRL）標準。 通過本課題的研究，在國內外研制出了三唑磷半抗原、抗三唑磷單克隆抗體及其ELISA試劑盒；在國內研制出了抗克百威單克隆抗體及其ELISA試劑盒；在國內系統建立了農藥等小分子化合物ELISA快速測定試劑盒國產化生物試劑的技術體系。試制的試劑盒產品經農業部農藥檢定所、農業部環境質量監督檢驗測試中心（天津）、等5家檢測機構應用，證明該技術可靠，產品質量和性能穩定，可用于指導生物試劑。（轉自 論文網）