H7亞型禽流感病毒單克隆抗體的如何制備及ELISA診斷方法的建立

研究采用高致病性禽流感病毒（Highly pathogenic avian influenza virus，HPAIV）A／FPV／Rostock／34（H7N1）（FPV）毒株作為免疫原，免疫8周齡BALB／C雌性小鼠，三次加強免疫后取脾細胞與SP2／0細胞融合，用血凝抑制試驗（HI）方法檢測篩選，陽性細胞克隆經有限稀釋法克隆培養，zui后獲得兩株H7亞型HA特異性單抗6H4和7F6，亞類分別為IgG2a、IgG2b，輕鏈都為k鏈，經檢測具有良好的特異性。采用純化的HPAIV A／FPV／Rostock／34（H7N1）（FPV）毒株作為免疫原，滅活后加入弗氏*佐劑和不*佐劑制成疫苗多次免疫山羊，獲得抗H7亞型禽流感的高免羊血清。 用羊血清作為捕獲抗體，H7亞型特異性單克隆抗體為檢測抗體，建立了檢測H7亞型高致病性禽流感病毒的雙抗體夾心ELISA方法。通過對各步反應條件進行優化，獲得的*工作條件為：羊血清1：1000倍稀釋，單抗1：40000稀釋，酶標抗體為1：5000倍稀釋，一抗反應時間1.5h，酶標抗體作用時間1.5h。 用建立的抗原捕捉ELISA方法對已知的NDV、EDS76、IBV、IBDV、ILTV、MDV和APV等禽類病毒以及其他15個HA亞型禽流感標準病毒株進行交叉反應性試驗，結果表明：建立的H7亞型高致病性禽流感抗原捕捉ELISA方法和其他禽類病毒以及其他亞型禽流感病毒均沒有明顯的交叉反應性，說明該方法對H7亞型高致病性禽流感病毒具有很好的特異性。 與血凝試驗（HA）和雞胚接種試驗相比，本實驗建立的抗原捕獲ELISA方法較HA敏感2倍以上，但不如雞胚接種試驗敏感。 利用優化的ELISA反應條件對人工感染的研究樣本進行檢測，通過對脾臟、腎臟、心臟、肺臟等多份陰陽性樣本的檢測zui終確定以心臟作為研究檢測的靶器官，并將0.099（OD_（490nm））作為臟器的陰陽性判定標準。 將試驗用的各種試劑及包被的反應板組裝成試劑盒，同時保存于室溫、4℃和-20℃，定期進行檢測，結果表明：試劑盒在室溫保存時極不穩定，保存期限很短，4℃和-20℃條件下都可以保存3個月以上。