20世紀(jì)中期，以放射免疫技術(shù)為代表的標(biāo)記免疫技術(shù)相繼問(wèn)世，它將某種可微量或超微量測(cè)定的物質(zhì)（如放射性核素、熒光素、酶、化學(xué)發(fā)光劑等）標(biāo)記于抗原（抗體）上制成標(biāo)記物，加入到抗原抗體的反應(yīng)體系中與相應(yīng)的抗體（抗原）反應(yīng)，以檢測(cè)標(biāo)記物的有無(wú)及含量間接反映被測(cè)物的存在與多少。這些將標(biāo)記技術(shù)與抗原抗體反應(yīng)結(jié)合起來(lái)的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)以其敏感性高、準(zhǔn)確性好、操作簡(jiǎn)便、易于商品化和自動(dòng)化等特點(diǎn)逐漸替代了凝集、沉淀等經(jīng)典的免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)，不僅用于抗原、抗體、補(bǔ)體、免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子等免疫相關(guān)物質(zhì)的檢測(cè)，也用于酶、微量元素、激素、微量蛋白等體液中各種微量物質(zhì)的檢查，可以說(shuō)一切具有抗原性或半抗原性的物質(zhì)原則上均可利用現(xiàn)代免疫檢驗(yàn)技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)，使免疫學(xué)檢驗(yàn)滲透到醫(yī)學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。

　　目前，免疫學(xué)檢驗(yàn)中的標(biāo)記技術(shù)主要包括酶免疫技術(shù)、熒光免疫技術(shù)、放射免疫技術(shù)、金免疫技術(shù)、化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)等。其中酶免疫技術(shù)是以酶標(biāo)記的抗體（抗原）作為主要試劑，將抗原抗體反應(yīng)的特異性和酶催化底物反應(yīng)的性和專一性結(jié)合起來(lái)的一種免疫檢測(cè)技術(shù)。作為經(jīng)典的三大標(biāo)記技術(shù)之一，酶免疫技術(shù)在檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)中得到廣泛應(yīng)用并不斷得到更新。

一、常用的酶及顯色底物

　　在酶免疫技術(shù)中用于標(biāo)記的酶應(yīng)具有催化活性高、催化專一性強(qiáng)；與抗原抗體偶聯(lián)后不影響抗原抗體的免疫反應(yīng)性和酶活性；催化的底物易于配制、保存且催化底物產(chǎn)生的信號(hào)產(chǎn)物易于觀察和檢測(cè)；對(duì)人無(wú)害且價(jià)廉、易得等特點(diǎn)，目前常用的酶及底物見(jiàn)表1。

表1 常用酶及底物

二、標(biāo)記物的制備

　　在酶免疫技術(shù)中制備標(biāo)記物的抗原應(yīng)純度高、抗原性完整；制備標(biāo)記物的抗體應(yīng)特異性好、效價(jià)高、親和力強(qiáng)、比活性高、能批量生物試劑和易于分離純化。

　　制備酶標(biāo)記物的方法應(yīng)符合簡(jiǎn)單、產(chǎn)量高；避免酶、抗體（抗原）、酶標(biāo)記物各自形成聚合物；標(biāo)記反應(yīng)不影響酶的活性和抗原抗體的免疫反應(yīng)性等原則。標(biāo)記物制備的方法基本屬于兩類：

（一） 交聯(lián)法

　　交聯(lián)法是以一可同時(shí)與酶和抗體（抗原）結(jié)合的 交聯(lián)劑作為“橋”，分別連接酶與抗體（抗原）的方法，此類方法中目前zui常用的是戊二醛交聯(lián)法，形成的結(jié)合物為：酶-戊二醛-抗體（抗原）

（二） 直接法

　　直接法是用一活化劑首先將酶活化，被活化的酶分子上的基團(tuán)直接可與抗體（抗原）結(jié)合形成標(biāo)記物，如過(guò)碘酸鈉法。形成的結(jié)合物為：酶-抗體（抗原）。

三、酶免疫技術(shù)類型

　　酶免疫技術(shù)按照抗原抗體系統(tǒng)是定位于組織細(xì)胞上還是存在于液體樣品中分為酶免疫組化技術(shù)和酶免疫測(cè)定（EIA），酶免疫測(cè)定又可分為均相酶免疫測(cè)定和異相酶免疫測(cè)定。

（一） 均相酶免疫測(cè)定

　　均相酶免疫測(cè)定是利用酶標(biāo)記物結(jié)合成抗原抗體復(fù)合物后，標(biāo)記酶的活性就受到抑制，因而反應(yīng)后不需分離結(jié)合的和游離的酶標(biāo)記物，直接測(cè)定系統(tǒng)中的總標(biāo)記酶的活性的變化，即可確定結(jié)合的酶標(biāo)記物的數(shù)量，從而得到待測(cè)物的含量的一種技術(shù)。常用于半抗原或小分子抗原如藥物、激素等的測(cè)定。常用的技術(shù)類型有：

1．酶免疫增強(qiáng)測(cè)定技術(shù)（EMIT）：酶免疫測(cè)定增強(qiáng)技術(shù)中酶活性的抑制是由于標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合后空間位阻了酶與底物結(jié)合的部位而造成的。反應(yīng)模式常用競(jìng)爭(zhēng)法，即當(dāng)未標(biāo)記抗原多，競(jìng)爭(zhēng)性的與抗體結(jié)合多，則標(biāo)記抗原與抗體結(jié)合少，酶的活性受到抑制少，酶活性高。因此，zui終測(cè)得的酶活性與未標(biāo)記物的含量呈正相關(guān)。
 

2．克隆酶供體免疫分析（CEDIA）：克隆酶供體免疫分析中酶是以供體和受體兩個(gè)片段存在的，只有兩個(gè)片段結(jié)合在一起形成全酶才能具有活性，當(dāng)標(biāo)記了供體酶的抗原與抗體結(jié)合后就空間位阻了酶供體（ED）與酶受體（EA）的結(jié)合，從而不能形成有活性的全酶，酶活性受到抑制。在反應(yīng)模式上同樣為競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合分析方法，zui終測(cè)得的酶活性與未標(biāo)記抗原的含量呈正相關(guān)。
 

（一） 異相酶免疫測(cè)定

　　異相酶免疫測(cè)定與均相酶免疫測(cè)定的zui大區(qū)別是抗原抗體反應(yīng)平衡后，在反應(yīng)體系中同時(shí)存在著游離的和結(jié)合的兩種酶標(biāo)記物，兩種標(biāo)記物上的酶都具有酶活性，而只有結(jié)合的酶標(biāo)記物的形成與含量才代表待測(cè)物的存在與含量。因此，需將游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物分離，測(cè)定結(jié)合狀態(tài)的酶標(biāo)物的活性推算待測(cè)物的含量。因分離游離和結(jié)合的標(biāo)記物的方法不同，異相酶免疫測(cè)定又分成液相酶免疫測(cè)定和固相酶免疫測(cè)定兩類方法。液相酶免疫測(cè)定，由于游離的和結(jié)合的標(biāo)記物都存在于液相中，故需用分離劑將二者分開(kāi)后才能測(cè)定結(jié)合狀態(tài)的酶標(biāo)記物的活性。而固相酶免疫測(cè)定，是通過(guò)載體將結(jié)合狀態(tài)的酶標(biāo)記物吸附在固相支持物上，只需洗滌就可將游離的酶標(biāo)記物去除。目前固相酶免疫測(cè)定以酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）為zui常用。

　　綜上所述酶免疫技術(shù)的類型可歸納為：

一、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）

（一） 基本原理

　　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的基本原理是將過(guò)量抗體（抗原）包被于載體上，通過(guò)抗原抗體反應(yīng)使酶標(biāo)記抗體（抗原）也結(jié)合在載體上，經(jīng)洗滌去除游離的酶標(biāo)記抗體（抗原）后，加入底物顯色，定性或定量分析有色產(chǎn)物確定待測(cè)物的存在與含量的檢測(cè)技術(shù)。

（二） 技術(shù)類型

　　酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)的主要技術(shù)類型有雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、捕獲法等。

1．各種技術(shù)類型的原理如下：雙抗體夾心法用于檢測(cè)抗原。它是利用待測(cè)抗原上的兩個(gè)抗原決定簇A和B分別與固相載體上的抗體A和酶標(biāo)記抗體B結(jié)合，形成抗體A-待測(cè)抗原-酶標(biāo)抗體B復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗原含量成正比，屬非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)類型。

　　間接法用于測(cè)定抗體。它的原理是將已知抗原連接在固相載體上，待測(cè)抗體與抗原結(jié)合后再與酶標(biāo)二抗結(jié)合，形成抗原-待測(cè)抗體-酶標(biāo)二抗的復(fù)合物，復(fù)合物的形成量與待測(cè)抗體量成正比，屬非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)類型。

　　競(jìng)爭(zhēng)法既可用于檢測(cè)抗原又可用于檢測(cè)抗體。它是用酶標(biāo)抗原（抗體）與待測(cè)的非標(biāo)記抗原（抗體）競(jìng)爭(zhēng)性的與固相載體上的*抗體（抗原）結(jié)合，待測(cè)抗原（抗體）多，則形成非標(biāo)記復(fù)合物多，酶標(biāo)抗原與抗體結(jié)合就少，也就是酶標(biāo)記復(fù)合物少，因此，顯色程度與待測(cè)物含量成反比。

　　捕獲法用于測(cè)定IgM類抗體。固相載體上連接的是IgM的二抗，先將標(biāo)本中的IgM類抗體捕獲，防止IgG類抗體對(duì)IgM測(cè)定的干擾，此步驟也是其稱為捕獲法的原因所在，然后再加入特異抗原和酶標(biāo)抗體，形成抗體IgM-IgM-特異抗原-酶標(biāo)抗體的復(fù)合物，復(fù)合物含量與待測(cè)IgM成正比，也屬非競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)類型。

2.各種技術(shù)類型的主要區(qū)別：見(jiàn)表2 。

表2 ELISA常用技術(shù)類型比較

（三） 技術(shù)要求

1.常用的固相載體：ELISA中zui常用的固相載體用聚苯乙烯制備，可制成微量反應(yīng)板、小試管和小株，現(xiàn)多用微量反應(yīng)板，它吸附性能好、空白值低、孔底透明度高、批間穩(wěn)定性好、價(jià)格低廉且易于與自動(dòng)化儀器配套。另外，聚乙烯、聚氯乙烯酰胺等塑料制品也有使用。除塑料外，還可使用膜載體（如硝酸纖維素膜）、磁化微顆粒等。

2．固相包被物的制備：固相包被物的制備方法可以是吸附或化學(xué)偶聯(lián)。用聚苯乙烯做載體包被抗原（抗體）常用吸附的方法。4℃放置一夜或37℃2～6h經(jīng)清洗后即可應(yīng)用。為防止包被后載體上留有未包被的空隙而導(dǎo)致本底過(guò)高，常用1％～5％牛血清白蛋白封閉空隙。

3．*工作濃度的選擇：在酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中為防止本底高和靈敏度低，需要對(duì)包被抗體（抗原）和酶標(biāo)抗體（抗原或二抗）進(jìn)行滴定和選擇*工作濃度。如夾心法*工作濃度的選擇是用棋盤滴定法同時(shí)選擇包被抗體和酶標(biāo)抗體的工作濃度。如表三所示包被抗體選擇3個(gè)濃度酶標(biāo)抗體也選擇3個(gè)濃度分別與包被抗體的3個(gè)濃度配伍，然后分別加入強(qiáng)陽(yáng)性抗原、弱陽(yáng)性抗原和陰性對(duì)照，得到27個(gè)A值，以強(qiáng)陽(yáng)性抗原A值在0.8，陰性對(duì)照A值<0.1為*工作條件，按照表3的測(cè)定結(jié)果可知包被抗體的*工作濃度是1mg/L，酶標(biāo)抗體的工作濃度是1：5,000。

表3 雙抗體夾心法包被抗體和酶標(biāo)抗體工作濃度選擇的棋盤法

二、酶免疫技術(shù)的發(fā)展

　　酶免疫測(cè)定具有高度敏感性、特異性，而且它的試劑比較穩(wěn)定，操作簡(jiǎn)單且無(wú)放射性危害，特別是商品試劑盒和自動(dòng)化儀器的應(yīng)用，使其成為一種適用于各級(jí)檢驗(yàn)部門的免疫標(biāo)記技術(shù)。隨著檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)的不斷發(fā)展，酶免疫測(cè)定的方法、技術(shù)也得到發(fā)展和更新，斑點(diǎn)-ELISA、發(fā)光酶免疫測(cè)定、免疫印跡法、BAS-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等方法不斷得到應(yīng)用。

（一）斑點(diǎn)-ELISA

　　斑點(diǎn)-ELISA的原理與ELISA的區(qū)別在于用對(duì)蛋白質(zhì)有*吸附力的硝酸纖維素膜代替塑料制品作為固相載體，酶作用底物后在硝酸纖維素膜上形成有色沉淀而使膜著色。它的靈敏度較一般ELISA高6～8倍、可達(dá)ng水平，試劑用量小，不需其它設(shè)備條件。

（二）免疫印跡法

　　免疫印跡法是將電泳與ELISA結(jié)合起來(lái)的一種方法。它先經(jīng)十二烷基磺酸鈉-聚苯烯酰胺凝膠電泳將樣品進(jìn)行分離，通過(guò)轉(zhuǎn)印將被分離的各區(qū)帶原位轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，然后把印有蛋白質(zhì)條帶的膜當(dāng)成包被抗原的固相載體，做酶免疫測(cè)定。所以它的方法分為電泳、轉(zhuǎn)印、酶免疫測(cè)定三個(gè)階段。免疫印跡法結(jié)合了電泳的高分辨率和酶免疫測(cè)定的高敏感性和特異性，是一種能用于分析樣品組分的免疫學(xué)測(cè)定方法。

（三）發(fā)光酶免疫測(cè)定

　　發(fā)光酶免疫測(cè)定與一般EIA的區(qū)別是酶所催化的底物是發(fā)光劑。產(chǎn)物不是一般EIA的有色物質(zhì)，而是發(fā)光產(chǎn)物，所發(fā)出的光可用特定的儀器測(cè)定。常用的酶是HRP和AP，HRP的發(fā)光底物有魯米諾及衍生物、對(duì)-羥基苯乙酸；AP的底物為3-（2--螺旋金剛烷）-4-甲氧基-（3-磷酸氧基）-苯基-1，2-二氧乙烷和4-甲基傘形酮磷酸鹽。

（四）BAS-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

　　BAS-酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)是將生物素-親和素（BAS）放大系統(tǒng)與ELISA結(jié)合起來(lái)的一種技術(shù)。生物素（B）是一種小分子的生長(zhǎng)因子，有兩個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其中一個(gè)可以和親和素結(jié)合，另一個(gè)可以和包括酶、抗原（抗體）的多種物質(zhì)結(jié)合。親和素（A）又稱卵白素，有4個(gè)亞基，都可與生物素穩(wěn)定結(jié)合，此為放大系統(tǒng)的關(guān)鍵，即有1個(gè)親和素就能結(jié)合4個(gè)生物素，親和素也可被酶標(biāo)記。

　　在BAS的應(yīng)用中正是利用了生物素和親和素的這些特點(diǎn)，設(shè)計(jì)了兩類反應(yīng)類型：一類是以游離親和素為“橋”，分別連接生物素化抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)和酶標(biāo)生物素。此種類型有BAB法和ABC法，另一類是直接用標(biāo)記親和素連接生物素化抗原抗體反應(yīng)系統(tǒng)，此種類型有BA法。以雙抗體夾心法測(cè)抗原為例，各種類型的反應(yīng)式表示如下。

BAB法的反應(yīng)式可表示為：固相抗體＋待測(cè)抗原＋抗體-生物素＋親和素＋生物素-酶＋底物。

ABC法的反應(yīng)式可表示為：固相抗體＋待測(cè)抗原＋抗體-生物素＋親和素＋生物素-酶-底物。

BA法的反應(yīng)式可表示為：固相抗體＋待測(cè)抗原＋抗體-生物素＋親和素-酶＋底物。

這種通過(guò)BAS放大作用可將更多的酶聚集在固相載體上，使酶免疫技術(shù)檢測(cè)的靈敏度進(jìn)一步得到提高。