丙酮酸脫氫酶（PDH）試劑盒的測定步驟，注意事項(xiàng)以及計(jì)算方法

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測定步驟

1. 調(diào)零

用蒸餾水于605nm處調(diào)零。

1. 樣本測定

（1）取900μL工作液加入1mL玻璃比色皿，在37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）中孵育5min。

（2）取出比色皿，加入50μL酶液，混勻；立即記錄605nm處初始吸光值A1，37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其它物種）中準(zhǔn)確反應(yīng)1min，記錄605nm處1min后的吸光值A2，計(jì)算ΔA=A1-A2。

丙酮酸脫氫酶（PDH）試劑盒注意事項(xiàng)

1、測定過程中所有試劑和樣本在冰上放置，以免變性和失活。

2、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃或25℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃或25℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃或25℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。

3、兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

PDH活性計(jì)算

1、組織中PDH活性計(jì)算:

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

 PDH活性（U/mg prot）=反應(yīng)總體積（950μL）÷樣本體積（50μL）÷反應(yīng)時(shí)間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(shù)（21×10^-3）×ΔA ÷蛋白濃度(mg/mL)=905×ΔA÷蛋白濃度(mg/mL)

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

 PDH（U/g 鮮重）=反應(yīng)總體積（950μL）÷樣本體積（50μL）÷反應(yīng)時(shí)間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(shù)（21×10^-3）×ΔA ÷樣本鮮重(g/mL)=905×ΔA ÷樣本鮮重(g/mL)

2、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞中PDH活性計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

 PDH活性（U/mg prot）=反應(yīng)總體積（950μL）÷樣本體積（50μL）÷反應(yīng)時(shí)間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(shù)（21×10^-3）×ΔA ÷蛋白濃度(mg/mL)=905×ΔA÷蛋白濃度(mg/mL)

（2） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘消耗1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定義為一個(gè)酶活性單位。

PDH活性（U/10⁴ cell）=反應(yīng)總體積（950μL）÷樣本體積（50μL）÷反應(yīng)時(shí)間(1min)÷2,6-二氯吲哚酚消光系數(shù)（21×10^-3）×ΔA ÷細(xì)菌或細(xì)胞密度(10⁴ cell /mL)=905×ΔA÷細(xì)菌或細(xì)胞密度(10⁴ cell /mL)

丙酮酸脫氫酶（PDH）試劑盒