信帆生物代做：EMSA實驗，解析EMSA實驗常見問題分析

1. 什么是凝膠遷移或電泳遷移率實驗?

凝膠遷移或電泳遷移率實驗(EMSA)是一種研究DNA結合蛋白和其相關的DNA結合序列相互作用的技術，可用于定性和定量分析。這一技術zui初用于研究DNA結合蛋白，目前已用于研究RNA結合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。

通常將純化的蛋白和細胞粗提液和32P同位素標記的DNA或RNA探針一同保溫，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物和非結合的探針。DNA復合物或RNA復合物比非結合的探針移動得慢。同位素標記的探針依研究的結合蛋白的不同，可是雙鏈或者是單鏈。當檢測如轉錄調控因子一類的DNA結合蛋白，可用純化蛋白，部分純化蛋白，或核細胞抽提液。在檢測RNA結合蛋白時，依據目的RNA結合蛋白的位置，可用純化或部分純化的蛋白，也可用核或胞質細胞抽提液。競爭實驗中采用含蛋白結合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特異)，和其它非相關的片段(非特異)，來確定DNA或RNA結合蛋白的特異性。在競爭的特異和非特異片段的存在下，依據復合物的特點和強度來確定特異結合。

2. 實驗中需要用到什么試劑?

凝膠遷移實驗需要的結合蛋白，可來源于純化或部分純化的蛋白，或粗的核和胞質抽提液。還必須制備同位素標記的DNA或RNA。一般，DNA核苷酸探針用32P和T4多核苷酸激酶來作末端標記，同位素標記的RNA用噬菌體RNA聚合酶和同位素標記的核苷酸在體外合成。Promega公司的Riboprobe/sup系統(a,b)可用于同位素標記的RNA的體外合成，DNA 5'末端標記系統，用于制備DNA探針，結合反應所需的組分有：含鹽的溶液(氯化鎂，氯化鈉，或氯化鉀)、緩沖體系(Tris-HCl或HEPES)、還原劑(DTT)、甘油、非特異的競爭DNA(poly(dI:dC)dI:dC)，也可能含非離子去污劑。在結合蛋白和同位素標記的探針作用后，在非變性的聚丙烯凝膠電泳上，分離復合物，隨后將凝膠干燥并放射自顯影，或用PhosphorImage/sup分析。

3. 凝膠遷移實驗系統提供了什么試劑?

Promega公司提供一種凝膠遷移實驗系統檢測DNA結合蛋白，系統可作為這類實驗的一種陽性對照。系統包括目的寡核苷酸，對照DNA結合蛋白，結合緩沖液，用于寡核苷酸探針末端標記所需的試劑。Core 系統包括含重組AP2蛋白(AP2抽提液)的大腸桿菌抽提液和AP2的同源寡核苷酸。AP2抽提液是從表達AP2蛋白的大腸桿菌中提取的。另外，Core系統還含SP1同源寡核苷酸，凝膠遷移結合緩沖液，和能作20次對照實驗的HeLa核抽提液。Complete系統含另外5個雙鏈寡核苷酸，分別是AP1、OCT1、CREB、nf-kb、 TFIID結合位點的同源序列。這些寡核苷酸可以在末端標記后用作特異性探針，或在競爭實驗中用作非特異性探針。

4. 成功進行凝膠遷移實驗，需要優化哪些因素?

凝膠遷移實驗在理論上很簡單也很快速，但要成功地進行凝膠遷移實驗，需要優化一些參數，這主要受結合蛋白的來源和探針結合位點特點的影響。以下是需要優化的因素：抽提液的制備(核酸酶和磷酸酶污染會使探針降解)，結合蛋白的濃度，探針的濃度，非特異性探針的濃度，緩沖液的配方和pH，聚丙烯凝膠電泳的特點和電泳條件，保溫時間和溫度，載體蛋白，是否有輔助因子(比如鋅，或鎘等金屬離子，或激素)?？傊?，反應總體積應zui小(20μl)。為滿足一般要求，結合緩沖液含4%甘油，1mM MgCl2，0.5mM EDTA，0.5mM DTT，50mM NaCl，10mM Tris-HCl(pH7.5)， 0.05mg/ml poly dI:dC，或10mM HEPES(pH7.9)， 50mM KCl，1mM DTT， 1mM EDTA，10%甘油，0.05mg/ml poly dI:dC可作為優化實驗的起始。

5. 在DNA探針的選擇上，要考慮哪些重要因素?

目的DNA的長度應小于300bp，以有利于非結合探針和蛋白DNA復合物的電泳分離。雙鏈的合成的寡核苷酸和限制性酶切片段可在凝膠遷移實驗中用作探針。如目的蛋白已被鑒定，則應用短的寡核苷酸片段(約為25bp)，這樣結合位點可和其他因子的結合位點區別開。長的限制性酶切片段可用于對推定的啟動子/增強子區域內的蛋白結合位點定位。隨后可用DNaseI印跡對蛋白結合的特異區域在DNA序列水平上作出分析。

6. 用以下一些轉錄調節因子和HeLa細胞核抽提物可形成哪些復合物：AP1, AP2, CREB, NFkB, Oct1, Sp1, TFIID, TFIIB。

當用HeLa細胞核抽提物作為結合蛋白的來源時，每1個轉錄調節因子和它相關的DNA同源序列結合形成特征型的結合形態。以下的文字描述了每一個單獨的轉錄調節因子，包括識別的同源序列，因子的大小，特定的結合條件，以及和HeLa細胞核抽提物可形成的復合物的數目。

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