上海信帆生物：酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)法

一、原理

植物激素（planthormone）免疫定量主要有放射免疫分析（RIA）和酶聯(lián)吸附免疫分析（ELISA），由于前者操作上欠安全等原因，目前常采用后一種類(lèi)型。在ELISA中，抗原抗體反應(yīng)的檢測(cè)依靠酶標(biāo)記物來(lái)實(shí)現(xiàn)，常用的酶有辣根過(guò)氧化物酶和堿性磷酸酯酶。酶可直接標(biāo)記激素分子，稱(chēng)為酶標(biāo)植物激素，也可標(biāo)記于第二抗體（識(shí)別抗激素抗體Fc片段的抗體或金黃色葡萄球菌A蛋白），稱(chēng)為酶標(biāo)二抗。這兩類(lèi)標(biāo)記物分別用于固相抗體型和固相抗原型ELISA。A.固相抗體型ELISA：將抗激素的單克隆抗體（Mab）與已吸附于固相載體上的兔抗鼠Ig抗體（RAMIG）結(jié)合，然后加入激素標(biāo)準(zhǔn)品或待測(cè)樣品，使其與固相化的Mab結(jié)合， 再加入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記激素（酶標(biāo)激素）。通過(guò)測(cè)定酶標(biāo)激素的被結(jié)合量，可換算出未知樣品中激素的數(shù)量。B.固相抗原型ELISA：將“激素-蛋白”復(fù)合物（該蛋白應(yīng)不同于免疫原中的載體蛋白）包被于固相載體，加入待測(cè)激素（樣品或標(biāo)準(zhǔn)品）和抗IAA多克隆抗體（Pab）反應(yīng)，進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。然后讓HRP標(biāo)記羊抗兔Ig抗體（HRP-GARIG）與結(jié)合在固相上的Pab反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定與固相結(jié)合的酶量，換算出未知樣品中激素的含量。

二、材料、儀器設(shè)備及試劑 

（一）材料：高等植物、真菌、藻類(lèi)等組織或器官。

（二）儀器設(shè)備：1. 酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀；2. 高速冷凍離心機(jī)；3. 恒溫箱；4. 連續(xù)進(jìn)樣器；5. 渦旋儀；6. 96孔微孔板；7. 離心管；8. 研缽或勻漿器；9. 試管。

（三）試劑1. 洗滌緩沖液：0.01mol/L pH7.4磷酸緩沖液（PBS），含0.05％Tween-0；2. RAMIG溶液，或“激素-蛋白”復(fù)合物；3. 0.1％封閉蛋白（該蛋白應(yīng)不同于免疫原中的載體蛋白）；4. 抗激素Mab，或Pab；5. 激素標(biāo)準(zhǔn)品母液，及參比系列溶液（按雙倍或四倍系列稀釋?zhuān)?. HRP標(biāo)記激素，或HRP-GARIG；7. 鄰苯二胺（OPD）基質(zhì)液：5mgOPD溶于12.5ml0.01mol/L pH5.0PBS，用前加入30％H2O212.5μl。

三、實(shí)驗(yàn)步驟 

固相抗體型elisa。
1. 用方陣法滴定選擇各反應(yīng)物zui適工作濃度；
2. 將100μlRAMIG溶液包被聚苯乙烯反應(yīng)板微孔，4℃濕盒，12h；
3. 棄去孔內(nèi)溶液，用洗滌緩沖液洗滌3次，甩干；
4. 加入100μl抗激素Mab溶液，37℃70min；