PI染色實驗代測

PI染色實驗代測

PI染色簡介：

碘化丙啶( propidium iodide,PI )檢測早期死亡細胞膜通透性狀態的不同是區分細胞凋亡和壞死的一一個重要指標,凋亡細胞在進入最終溶解階段前,細胞膜通透性無明顯改變,相對分子質量大的與DNA結合的熒光染料(如PI )不能進入凋亡細胞內,而相對分子質量小的熒光染料(如Hoechest 3342或33258等)仍能被細胞攝取。應用流式細胞儀或熒光顯微鏡可區分和壞死細胞,細胞內DNA出現Hoechest 3342 標記而不出現PI標記的為凋亡細胞。

PI染色原理：

主要是根據細胞凋亡時在細胞、亞細胞和分子水平上所發生的特征性改變。這些改變包括細胞核的改變、細胞器的改變、細胞膜成分的改變和細胞形態的改變等，其中細胞核的改變具有特征性。

PI實驗說明：

1、PI染色拍照使用的是熒光拍照。

實驗步驟（僅供參考）：

1、收集細胞{數目約（1~ 5）×106個/mL}，500 ~ 1000 r/min離心5min，棄去培養液。

2、3ml　PBS洗滌1次。

3、離心去PBS，加入冰預冷的70%的乙醇固定，4℃，1—2小時。

4、離心棄去固定液，3mlPBS重懸5min。

5、400目的篩網過濾1次，500—1000r/min離心5min，棄去PBS

6、用1ml　PI染液染色，4℃避光30min。

7、流式細胞儀檢測：PI用氬離子激發熒光，激光光波波長為488nm，發射光波波長大于630nm，產生紅色熒光分析PI熒光強度的直方圖也可分析前散射光對側散射光的散點圖。

8、結果判斷：在前散射光對側散射光的散點圖或地形圖上，凋亡細胞與正常細胞相比，前散射光降低，而側散射光可高可低，與細胞的類型有關；在分析PI熒光的直方圖時，先用門技術排除成雙或聚集的細胞以及發微弱熒光的細胞碎片，在PI熒光的直方圖上，凋亡細胞在G1/G0期前出現一亞二倍體峰。如以G1/G0期所在位置的熒光強度為1.0，則一個典型的凋亡細胞樣本其亞二倍體峰的熒光強度為0.45，可用雞和鮭魚的紅細胞的PI熒光強度做參照標準，兩者分別為0.35和0.7，可以確保在兩者之間的不是細胞碎片而是完整的細胞。

PI染色實驗代測