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免疫共沉淀(Co-IP蛋白與蛋白)

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎(chǔ)的用于研究蛋白質(zhì)相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質(zhì)在完整細(xì)胞內(nèi)生理性相互作用的有效方法。當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用被保留了下來(lái)。當(dāng)用預(yù)先固化在agarose，beads.上的蛋白質(zhì)A的抗體免疫沉淀A蛋白,那么與A蛋白在體內(nèi)結(jié)合的蛋白質(zhì)B也能一起沉淀下來(lái)。再通過(guò)蛋白變性分離，對(duì)B蛋白進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)而證明兩者間的相互作用。這種方法得到的目的蛋白是在細(xì)胞內(nèi)與興趣蛋白天然結(jié)合的，符合體內(nèi)實(shí)際情況，得到的結(jié)果可信度高。這種方法常用于測(cè)定兩種目標(biāo)蛋白質(zhì)是否在體內(nèi)結(jié)合;也可用于確定一種特定蛋白質(zhì)的新的作用搭檔。

CHIP實(shí)驗(yàn)(DNA-蛋白相互作用)

染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)的原理是:在生理狀態(tài)下把細(xì)胞內(nèi)的DNA與蛋白質(zhì)交聯(lián)在一起,通過(guò)超聲或酶處理將染色質(zhì)切為小片段后,利用抗原抗體的特異性識(shí)別反應(yīng)，將與目的蛋白相結(jié)合的DNA片段沉淀下來(lái)。染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)一般包括細(xì)胞固定，染色質(zhì)斷裂，染色質(zhì)免疫沉淀，交聯(lián)反應(yīng)的逆轉(zhuǎn)，DNA 的純化，以及DNA的鑒定。因?yàn)?/span>ChIP實(shí)驗(yàn)涉及的步驟多，結(jié)果的重復(fù)性較低，所以對(duì)ChIP實(shí)驗(yàn)過(guò)程的每一步都應(yīng)設(shè)計(jì)相應(yīng)的對(duì)照，而且對(duì)結(jié)果的分析也需要有一定的經(jīng)驗(yàn)。對(duì)于剛剛開(kāi)始使用ChIP技術(shù)的研究人員來(lái)說(shuō)，使用成熟的商品化試劑盒和相關(guān)的技術(shù)服務(wù)會(huì)達(dá)到事半功倍的效果。

RIP實(shí)驗(yàn)基本原理:

1.用抗體或表位標(biāo)記物捕獲細(xì)胞核內(nèi)或細(xì)胞質(zhì)中內(nèi)源性的RNA結(jié)合蛋白。

2.防止非特異性的RNA的結(jié)合。

3.免疫沉淀把RNA結(jié)合蛋白及其結(jié)合的RNA-起分離出來(lái)。

4.結(jié)合的RNA序列通過(guò)mi scroarrax(RIP-Chip),定量RT-PCR或高通量測(cè)序(RIP-Seq)方法來(lái)鑒定。

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